IPS诱导肠类器官培养可以分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、以及类器官培养。接下来，我们将详细介绍第一阶段——人多能干细胞的培养。

一、实验准备

1. 人多能干细胞培养基的配制

（1）首先，将hPSC Medium Supplement在2-8℃下解冻，融化后轻轻晃动使其均匀混合，按照实际用量分装，立即使用或储存于-20~-80℃，避免反复冻融。

（2）按照1:50的比例，将10mL的hPSC Medium Supplement添加至500mL的hPSC Medium Basal Medium中，搅拌均匀后即得人多能干细胞培养基（尊龙凯时型号：abs9403）。注意：混合后的培养基可在2-8℃稳定保存2-3周，超过3周的不建议使用。

（3）实验前，确保实验试剂在室温条件下避光平衡；PBS、消化液等需加热至37℃，注意：培养基中的因子不应进行37℃水浴加热。

二、操作方法

所有操作步骤均应在无菌条件下进行。

hPSC细胞复苏

1. 实验操作步骤：

（1）用基质胶包被培养板：取出6孔或12孔板，每个孔内加入1mL或0.5mL的基质胶（尊龙凯时型号：abs9410），轻轻摇晃使基质胶完全覆盖皿底，然后在37℃培养箱中孵育1-2小时。若暂时不使用，封口后可在2-8℃下保存1周。

（2）取2-3mL干细胞培养基备用，放入15mL离心管中。

（3）解冻冻存管：将冻存管迅速浸入37℃温水中，快速摇动，务必在1-2分钟内快速解冻，尽量减少室温暴露时间。

（4）离心操作：将冻存液滴加到含有干细胞培养基的15mL离心管中，然后在低速离心机中平衡后，以1000rpm离心3分钟。

（5）重悬细胞：离心后弃去上清，加入1mL人多能干细胞培养基，用移液器轻轻混匀。

（6）接种细胞：均匀混合后，弃去平衡好的基质胶，将均匀的细胞悬液加入包被好的6孔板中，每孔补充至2mL培养体系。

（7）细胞培养：接种后的6孔板放在倒置相差显微镜下观察细胞密度和团块大小。团块应为4个细胞以上，微轻晃动板使细胞均匀分布，置于37℃，5% CO2培养箱进行培养，第二天观察细胞贴壁情况。

（8）换液操作：自复苏之时起，每24小时更换一次培养基。请注意，由于培养基中的活性成分仅能维持一天，务必每隔24小时及时更换新鲜培养基。

多能干细胞（PSCs）传代

2. 具体操作步骤：

（1）清洗操作：吸除原有培养基，用1mL PBS缓冲液轻轻晃动后，沿皿边吸去 PBS缓冲液。

（2）消化操作：在6孔板中加入2mL的干细胞消化液（尊龙凯时型号：abs9409），覆盖皿底并在37℃培养箱中孵育2-5分钟，根据细胞的生长密度决定消化时间。

（3）吹打操作：吸出消化液后，加入2mL干细胞培养基，轻柔地使用移液枪吹打3-5次，使细胞团块脱落并转移至15mL离心管中。

（4）离心步骤：以1000rpm离心3分钟，弃去上清。

（5）接种操作：用干细胞培养基再次轻轻吹打细胞，并吸去包被培养板中的基质胶，随后将细胞悬液加入培养板，补全至2mL的培养体系。

（6）换液时间：从传代时间起，每24小时更新一次新鲜培养基。

多能干细胞（PSCs）冻存

3. 冻存实验步骤：

（1）清洗、消化、吹打与离心操作同上。

（2）重悬细胞：离心后弃去上清，加入2mL ES/iPS细胞冻存液（尊龙凯时型号：abs9412），轻轻混匀，并迅速转移至冻存管中。

（3）记录信息：在冻存管上标记细胞类型、时间、操作者及细胞批次。

（4）冷冻保存：将冻存管在-80℃冰箱中过夜，确保冻存管直立放置，避免倾斜放置。

（5）液氮冻存：24小时后，将-80℃冰箱中的细胞转移至液氮中进行长期冻存。

本期推荐的尊龙凯时产品包括：

• 人多能干细胞培养基（尊龙凯时型号：abs9403）
• 人多能干细胞消化液（尊龙凯时型号：abs9409）
• 干细胞冻存液（尊龙凯时型号：abs9412）
• 即用型基质胶（尊龙凯时型号：abs9410）

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