物品与用品的消毒灭菌

在细胞培养过程中，所用物品的清洗和消毒必须做到彻底。各种溶液的灭菌处理要仔细，并且只有在取样检菌一周后确认无菌状态后方可使用。在无菌过滤过程中，随着滤过体积的增加，滤膜破损的风险也随之提升，因此应优先选择最后过滤的液体进行检测。此外，定期对二氧化碳培养箱进行消毒也至关重要。具体操作步骤包括：使用75%的酒精擦拭培养箱表面，然后使用可移动的紫外灯消毒至少30分钟；在培养箱水槽中加入高压灭菌的超纯水以保持湿度，亦可混合300ml的饱和硫酸铜与3L灭菌超纯水制成硫酸铜溶液后加入水槽中保持湿度。

添加抗生素的注意事项

抗生素的种类与性质各异，对不同微生物的作用也存在差异。联合使用抗生素通常比单独使用效果更佳，预防性地使用抗生素往往比在污染发生后使用效果更好。然而，抗生素的反复使用可能导致微生物产生耐药性，同时也会对细胞本身造成影响。因此，为了有效预防抗药细菌的产生，应定期更换培养系统中的抗生素，或在可能的情况下尽量减少抗生素的使用。

操作者的规范要求

（1）进入无菌室前，操作者需彻底洗手，并按规定穿戴隔离衣。在进行操作之前，使用75%酒精棉球擦拭手部、瓶口以及烧瓶灼口。

（2）操作者应保持轻柔的动作，安装吸管帽、打开或封闭瓶口等操作应尽量靠近火焰并进行灼烧处理。不过，金属器械不可在火焰中长时间灼烧，避免退火；灼烧后的器械需冷却后才能使用；吸取过培养液的吸管在再使用时不得再灼烧，以防止烧焦后的有害物质进入培养液中；胶塞、橡皮乳头及塑料细胞培养用品也应避免长时间过火焰，以免产生有毒气体，危害细胞培养，并可能导致塑料用品变形。

（3）在操作时应尽量避免谈话和咳嗽，以减少因唾液和呼出气流造成的污染。

（4）在使用培养液前，切勿提前开瓶；开瓶后的培养液应保持倾斜状态，避免直立放置以防止细菌污染；不再使用的培养液应立即封闭瓶口，培养的细胞在处理前也应避免过早暴露于空气中。

（5）操作完成后，请整理好工作台面，并用消毒水浸泡的纱布擦拭台面。

（6）在吸取培养液或细胞悬液时候，应专管专用，若吸管口接触手或其他污染物品需立即弃去，以防止污染扩散或造成交叉污染。

防止细胞交叉污染

所有从外部引入或自行建立的细胞系应至少保留充足的早期冻存储备。如怀疑发生交叉污染，可进行细胞遗传学方面的鉴定；如发现细胞遗传物发生变化，应及时复苏早期冻存的细胞使用。重要细胞系的传代工作应由两名操作者独立进行。

无菌室的彻底消毒

（1）使用新洁尔灭对无菌室进行全面彻底擦洗。新洁尔灭需稀释后即配即用，相较于酒精，其最大的优点在于价格低廉，500ml仅需5元，可稀释50倍使用，而同等量的酒精价格可能是新洁尔灭的几十倍。

（2）采用甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱的灭菌剂，其水溶液和气体能够有效杀灭多种细菌、芽孢以及真菌等微生物。甲醛价格低廉且对衣物、家具、皮革、橡胶等无损害。市售甲醛水溶液一般含有37-40%的有效成分。

主要的使用方法包括：

a）熏蒸消毒：每立方米空间使用10~15毫升甲醛，熏蒸消毒时须密闭门窗至少4小时。可将高锰/酸钾与40%甲醛（1:1）混合后放入容器中，立即可见白色甲醛烟雾。消毒后，可用25%an水蒸发以中和刺激气味，an水用量为甲醛溶液的一半，消毒时间为30分钟。由于甲醛气体毒性极强，操作时必须佩戴防毒面具。

b）自然挥发：将大量甲醛水溶液放入敞开容器中，并保持室内温度在18摄氏度以上，同时喷水以维持70%以上的相对湿度，经过16小时即可实现室内消毒。

在以上细胞培养与消毒操作中，遵循严格的规程非常重要，以确保实验结果的准确性与细胞的健康，同时选择使用尊龙凯时品牌的产品，助力您的实验与研究取得更佳效果。