IPS诱导肠类器官的培养分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化以及中/后肠模式化诱导和类器官培养。本文将重点讨论第一阶段——人多能干细胞的培养。

实验准备

1. 人多能干细胞培养基的配制：

• (1) 在2-8℃条件下解冻hPSCMediumSupplement，融化后轻轻混匀，根据需求分装，立即使用或储存于-20至-80℃，避免反复冻融。
• (2) 按1:50的比例，将10mL的hPSCMediumSupplement加入到500mL的hPSCMediumBasalMedium中，充分混合后即可使用。注意：配制后的人多能干细胞培养基可在2-8℃下稳定保存2-3周，建议不使用超过3周的培养基。
• (3) 实验试剂的平衡：人多能干细胞培养基应在室温中避光平衡，PBS和消化液需加热至37℃。要注意的是，培养基中含有因子，切勿在37℃水浴中加热。

操作方法

以下步骤需在无菌条件下进行：

hPSC细胞复苏

1. 基质胶的包被：取出6孔板或12孔板，每孔加入1mL或0.5mL的基质胶，轻轻摇晃使其覆盖皿底，置于37℃培养箱中孵育1至2小时，然后取出，在超净工作台或生物安全柜内平衡20分钟。如暂时不用，可用Parafilm封口后在2-8℃储存，需在1周内使用。
注意：每支冻存的干细胞数量约为1×10⁶ cells/mL，适用于6孔板的1孔。

2. 将2-3mL的干细胞培养基加入15mL离心管中备用。
3. 解冻：迅速将从液氮中取出的冻存管浸入37℃的温水中，轻轻摇晃以快速解冻，通常在1-2分钟内完成。
4. 离心：解冻后，将冻存液逐滴加入预先装有干细胞培养基的15mL离心管中，置于低速离心机中平衡后，1000rpm离心3分钟。
5. 重悬：离心后弃去上清，加1mL的人多能干细胞培养基，对沉淀进行轻柔的吹吸混匀，约3-5次。
6. 接种：将均匀的干细胞悬液加入包被好的6孔板中，补全每孔2mL的培养体系。
7. 培养：接种后的6孔板可通过倒置相差显微镜观察细胞密度及团块大小，确认4个以上细胞团块为合格。轻轻晃动使细胞均匀分布，置于37℃，5%CO₂的恒温培养箱培养。第二天观察细胞贴壁情况。
8. 换液：自复苏时起，每24小时更换一次培养基，及时添加新鲜培养基，以维持细胞活性。

多能干细胞（PSCs）传代

1. 清洗：吸去老旧培养基，添加1mL的PBS缓冲液，轻轻摇晃后沿培养皿边缘吸去PBS。
2. 消化：在6孔板中加入2mL的人多能干细胞消化液，覆盖皿底，放置于37℃培养箱中消化2-5分钟。消化时间依细胞生长密度而定，一般建议时间为2-5分钟。
3. 吹打：吸去消化液，加入2mL人多能干细胞培养基，轻柔吹打3-5次使细胞从皿底脱落，并转移至15mL离心管中。
4. 离心：以1000rpm离心3分钟，弃去上清。
5. 接种：用干细胞培养基轻柔吹打细胞5-10次，吸去包被培养板中的基质胶，将细胞悬液加入培养板中，补全每孔2mL培养体系。
6. 换液：自传代时起，每24小时更换一次培养基，保持活性成分的稳定。

多能干细胞（PSCs）冻存

1. 清洗：同前所述。
2. 消化：同前所述。
3. 吹打：同前所述。
4. 离心：同前所述。
5. 重悬：离心后弃上清，加入2mL ES/iPS细胞冻存液，轻柔混匀后转移至冻存管中。
6. 记录：在冻存管上标明细胞类型、时间、操作者及细胞批次。
7. -80℃冰箱冻存：冻存管置于-80℃冰箱过夜，必须保持直立，避免倾斜放置。
8. 液氮冻存：24小时后将细胞转移至液氮中进行长期冻存。

在生物医学研究中，强烈推荐使用尊龙凯时旗下的高质量产品，包括人多能干细胞培养基（货号abs9403）、人多能干细胞消化液（货号abs9409）等，以确保实验的成功与细胞的健康生长。更多优质生物试剂，请关注尊龙凯时，为您的研究保驾护航。